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細胞生長培養(yǎng)基和蛋白質生產

使用基于細胞的表達系統(tǒng)制備富含同位素的蛋白質是制備用于 NMR 分析的樣品的常用方法。迄今為止，用于表達標記蛋白的流行的生物體是大腸桿菌。哺乳動物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞用于表達蛋白質。大腸桿菌不能以可用的形式表達蛋白質。

CIL 提供了一系列豐富的試劑和產品來標記大腸桿菌、昆蟲、酵母和哺乳動物細胞，以生產適用于 NMR 實驗的均勻或選擇性標記的蛋白質。

細菌培養(yǎng)基

使用 e. 蛋白的過度表達。大腸桿菌是獲得標記蛋白質用于 NMR 研究的流行方法。這是通過增加 e 來實現的。大腸桿菌細胞并在適當的富含同位素的細胞培養(yǎng)基中誘導蛋白質表達?；九囵B(yǎng)基是僅包含葡萄糖或甘油或丙酮酸作為表達蛋白質的碳源和氯化銨或硫酸銨作為氮源的細胞培養(yǎng)基。豐富的培養(yǎng)基含有氨基酸以及用于蛋白質生產的一定水平的葡萄糖。

CIL 提供多種產品，用于表達用于 NMR 研究的標記蛋白質。這些包括用于基本培養(yǎng)基的試劑以及可直接使用或用水稀釋后即可使用的豐富細菌細胞培養(yǎng)基。CIL 還提供 Celtone 粉末，一種標記添加劑，用于基本培養(yǎng)基以及 Spectra 9 培養(yǎng)基，一種基本培養(yǎng)基，每升含有 1 克 Celtone 粉末。CIL 也銷售 e。由位于德國慕尼黑的 Silantes Gmbh 公司生產的大腸桿菌 OD 培養(yǎng)基。

昆蟲細胞培養(yǎng)基

將桿狀病毒表達系統(tǒng) (BEVS) 用于在同位素標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)的昆蟲細胞已被證明是生產同位素標記膜蛋白，最顯著的是 G 蛋白偶聯受體 (GPCR) 的成熟技術。CIL 自豪地開創(chuàng)了一種化學成分確定的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基已用于草地夜蛾 (SF9) 細胞。這種培養(yǎng)基 BioExpress 2000® 可以用統(tǒng)一標記或氨基酸特異性標記制造。未標記的試驗尺寸可用于在使用標記介質之前檢查可行性和優(yōu)化。請參閱 CIL 應用說明 14（“使用 BioExpress2000®（昆蟲細胞）培養(yǎng)基對桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達的蛋白質進行有效均勻同位素標記"）和 20（“有效位點特異性同位素標記（13C15N 甘氨酸；13C15N苯丙氨酸；15N 色氨酸）使用 BioExpress2000® 培養(yǎng)基進行表達優(yōu)化"）以獲取更多信息。

哺乳動物細胞培養(yǎng)基

隨著目標蛋白質的大小和復雜性增加，獲得在大腸桿菌中表達的正確折疊蛋白質的可能性。大腸桿菌減少。然后必須轉向使用真核細胞表達蛋白質，其中哺乳動物細胞系通常是選擇。CIL 自豪地提供 BioExpress 6000®，這是一種細胞培養(yǎng)基，適用于培養(yǎng)數量有限的哺乳動物細胞系。BioExpress 6000® 是一種化學成分確定的培養(yǎng)基，其配方以 DMEM 為模型，因此非常適合培養(yǎng) HEK293 細胞。要確定 BioExpress6000® 是否支持特定細胞系的生長，建議先在 DMEM 中培養(yǎng)細胞。如果 DMEM 支持細胞的生長，那么 BioExpress6000 也應該起作用。如果細胞需要存在胎牛血清 (FBS) 或胎牛血清 (FCS)，然后應將透析過的 FBS 或 FCS 與 BioExpress 6000® 結合使用。BioExpress 6000® 以粉末形式提供，并附有復原說明。通常培養(yǎng)基含有 CaCl，但是，CIL 提供了一種不含 CaCl2 的版本，用于非粘附生長。由于 BioExpress 6000® 是化學定義的，用戶可以需要標記的氨基酸（目錄號 CGM-6500-CUSTOM）。CIL 還提供未標記的 BioExpress 6000® 以在購買和使用標記版本之前評估生長情況。用戶可以需要標記的氨基酸（目錄號 CGM-6500-CUSTOM）。CIL 還提供未標記的 BioExpress 6000® 以在購買和使用標記版本之前評估生長情況。用戶可以需要標記的氨基酸（目錄號 CGM-6500-CUSTOM）。CIL 還提供未標記的 BioExpress 6000® 以在購買和使用標記版本之前評估增長。

酵母培養(yǎng)基和試劑

酵母是流行的用于蛋白質表達的真核細胞類型。酵母細胞易于生長、遺傳操作，并且可以產生高產量的表達蛋白。用于生產用于 NMR 目的的標記蛋白質的三個屬是畢赤酵母屬、酵母屬和克魯維酵母屬。Cambridge Isotope Labs 很高興為酵母表達和培養(yǎng)基提供各種標記碳源。

葉酸循環(huán)

葉酸代謝途徑在許多生理過程（例如氧化還原和氨基酸穩(wěn)態(tài)）和生化反應中起著核心作用。反應包括但不限于核苷酸和氨基酸（例如甲硫氨酸、高半胱氨酸）的合成和線粒體蛋白質翻譯。受抑制或異常的功能與全身性疾病（例如心血管疾病、神經退行性疾病）有關。為了協助化合物識別/量化及其功能評估，CIL 提供了一系列與葉酸循環(huán)相關的代謝物。產品中包括代謝物 5-甲基-四氫葉酸（5-甲基-THF），它與蛋氨酸循環(huán)有關，以及其他代謝中間體和反應物。這些主要以其整潔的形式作為研究級材料提供。

糖酵解

糖酵解是在 10 步反應中將葡萄糖轉化為丙酮酸的代謝途徑，同時利用釋放的能量進行細胞代謝。這種分解代謝途徑是普遍存在的，發(fā)生在原核和真核細胞中。為了補充該途徑中代謝物的分析，CIL 很高興提供許多其穩(wěn)定同位素標記的化合物。該化合物產品包括途徑終點（即葡萄糖和丙酮酸）及其中間體（例如，6-磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸）。這些化合物是研究級的，主要以純凈形式提供。

類固醇和激素

類固醇激素在許多生理過程（例如，水和電解質平衡）的調節(jié)中起著至關重要的作用。這組化合物分為 5 個主要類別：雄激素（例如二氫睪酮、睪酮）、糖皮質激素（例如雄烯二酮、脫氧皮質醇）、鹽皮質激素（例如醛固酮）、雌激素（例如雌二醇、雌酮）和孕激素（例如，孕酮）。類固醇激素的準確定量對于基礎和轉化研究至關重要，可以通過將穩(wěn)定同位素標記的類固醇標準用于液相色譜 (LC-) 或氣相色譜 (GC-) 質譜方法來實現。

CIL 以純凈和/或溶液形式提供未標記和穩(wěn)定同位素標記的甾體激素。請在下方查看我們的類固醇激素的可用性、價格和規(guī)格，并詢問是否需要更多信息或替代產品/標簽。其他資源是用于代謝研究的穩(wěn)定同位素標記產品目錄。

代謝同位素分析利用穩(wěn)定的同位素豐富的底物和質譜法來研究活細胞和組織的新陳代謝。由于同位素標記的底物可以確定活細胞或組織中的代謝途徑和通量，mia 已經成為腫瘤學研究的一個整合平臺。這個應用說明提供了一個用于研究小鼠代謝和培養(yǎng)人類細胞的例子，用于腫瘤學研究，總結了 nicolay 等人以前進行的研究，這些研究人員利用 mia 來研究蒼蠅模型中的視網膜母細胞瘤蛋白抑癌基因(prb)的失活。在提交的研究中，nicolay 和他的同事發(fā)現，成年小鼠組織中 prb 的急性缺失導致了葡萄糖氧化的快速變化(nicolay 等，2015)。這一隨后的研究表明，葡萄糖衍生的中間物在血液循環(huán)的線粒體在 prb-/-組織的功能低于 prb +/+ 組織。這些效應在 prb 缺失的人類細胞培養(yǎng)模型中被模仿。13c6-葡萄糖(cil 目錄編號: 1)的體內同位素分析。Clm-1396)在結腸和肺部使用類似于以前發(fā)表的工作的協議進行(范等人，2011; 萊恩等人，2011; yuneva 等人，2012; sellers 等人，2015)。簡單地說，給小鼠注射13c6葡萄糖，20分鐘后處死小鼠進行組織分離。最初的時間進展分析發(fā)現，注射20分鐘后，血液中13c6-葡萄糖的水平已經達到高峰，并且在糖酵解和 tca 循環(huán)的下游中間環(huán)節(jié)中持續(xù)了13c 的富集(圖1a-d)。以確定 rb +/+ 和 rbko 小鼠的葡萄糖清除率相似, 13c6- 葡萄糖濃度相同的葡萄糖耐量試驗(gtt)顯示，誘導后96 hrsafre 基因型之間沒有差異(圖1e)。這些對照實驗表明，用這個方法可以確定葡萄糖代謝產物的質量差異。為了支持 gtt 的結果，對血清中13c6-葡萄糖攝取的分析顯示 rb +/+ 和 rbkotolon 或肺組織之間沒有差異(圖2a)。相反，rb1的缺失引起兩組織中 m + 2檸檬酸鹽的顯著富集(雙倍)(圖1f)。組織中 m + 3丙酮酸或 m + 3乳酸的產生量沒有差異(圖1g，h)。有趣的是，在 rb1丟失后并沒有發(fā)現糖酵解增加(丙酮酸和乳酸的產生表明了這一點(圖2b，c))。這個奇怪的結果表明，紅細胞組織增加了葡萄糖進入 tca 的濃度。與此一致的是，一種定性測定丙酮酸脫氫酶(pdh)活性(m + 2檸檬酸/m + 3丙酮酸)的比率在 rb1丟失時顯著升高(圖1i)。此外，在兩個 rbko 組織中均觀察到 m + 2乙酰輔酶 a 明顯富集，在 rbko 肺組織中總乙酰輔酶 a 明顯增加(圖1j-k)。用這種方法我們不能直接定量測定 tca 循環(huán)活性。盡管如此，結果表明 prb 在體內的丟失并不會產生糖酵解表型，盡管進入 tca 循環(huán)的葡萄糖增多，但在相對高能條件下，atp 的產量卻下降了。引人注目的是，rbko rpe 細胞表現出明顯增加的充實 m + 2檸檬酸鹽(圖3a)。這種效應再次與圖1。體內13c6-葡萄糖分析 rb 的丟失對 tca 循環(huán)進入的影響。(a)13c6-葡萄糖命運通過丙酮酸氧化作用繪制 tca 循環(huán)圖，紅圈為13c，開放圈為12c。丙酮酸*由13c 組成，標記為 m + 3。使用的縮寫是: accoa-乙酰輔酶 a; alphakg-α- 酮戊二酸; co2-co2-succinate; mal-malate; fum-fumarate; oac-oxaloacetate; pyr-pyruvate。(b-d)對照組小鼠血液和組織中13c6- 葡萄糖鏈的動力學進行了研究。結果顯示，13c6- 葡萄糖注射后的時間點(i/p) ，小鼠血液或組織中13c6- 葡萄糖的富集率為9-24。(b)13c6葡萄糖從血液中清除的動力學。(c-d)13c6-葡萄糖氧化為糖酵解(m + 3丙酮酸鹽)和檸檬酸三鈣循環(huán)(m + 2檸檬酸鹽)中間體的動力學。數據趨勢是結腸和肺組織的代表; 顯示為結腸樣本的數據。(e)糖耐量試驗(gtt)顯示 rb 丟失后96h 小鼠基因型間葡萄糖吸收相似，n = 4小鼠/基因型。(f-h) rb 損失使結腸和肺中13c6葡萄糖衍生物升高，但不影響13c6葡萄糖衍生物丙酮酸或乳酸鹽，n = 8小鼠。(i) pdh 活性比(m + 2檸檬酸/m + 3丙酮酸)。Rb 丟失會導致結腸和肺部 pdhactivity 升高。(j-k) rb 的丟失增加了葡萄糖衍生的乙酰輔酶 a 的富集，增加了乙酰輔酶 a 的總庫。(l) rb 的損失影響體內的 atp 水平。誤差線是95% 的置信區(qū)間。P 值的統(tǒng)計顯著性如下: * < 0.05，* * < 0.02，* * < 0.001。Rb-/-和對照細胞的影響有統(tǒng)計學上的差異。

Pdh 活性升高的比率(圖3b)。這些結果表明 rb/rb1消融同樣影響小鼠和人睪丸組織丙酮酸氧化，而且這種變化與 rb/rb1消融對細胞增殖的影響無關。與細胞內分析不同，視網膜色素上皮細胞中13c6葡萄糖的24小時脈沖，會產生非標記的13c 檸檬酸鹽。由此我們估算了檸檬酸 m + 4/m + 2之間的 tcacycle 活性。M + 4檸檬酸代表13c 濃縮檸檬酸通過 tca 循環(huán)的第二個過程(圖1a)。因此，一個更大的比例將反映一個加速的 tca 周期。Rb1的丟失嚴重降低了這個比率(圖3c) ，證實了這些細胞的 tca 周期確實減少了。由于谷氨酰胺在體外的 tca 循環(huán)中也是一個大的碳氧化來源，我們對13c5- 谷氨酰胺衍生的 tca 中間體進行了類似的加脂處理，我們發(fā)現在 rbko rpe 細胞中13c5- 谷氨酰胺的氧化作用也減弱了(圖3d)。鑒于 rb1突變導致線粒體容量下降，我們測試了這些變化是否會造成細胞易感性。因此，我們將對照 rpe 和 rbko rpe 細胞培養(yǎng)72小時，葡萄糖濃度從5mm 降低到1mm。令人印象深刻的是，與對照細胞相比，這種營養(yǎng)物質的轉移本身導致 rbko rpe 細胞的生長減少了50% (圖3e)。加用兩種不同的氧化磷酸化抑制劑(魚藤酮和苯乙雙胍，兩種 ci 抑制劑)進一步降低 rbko rpe 細胞與同樣處理的對照細胞相比的活性(圖3 f)。這些結果有力地支持了 rb/rb1的喪失會損害氧化磷酸化能力的結論，并表明線粒體的變化具有生理后果。關于研究方法和進一步的研究細節(jié)，請參閱 pubmedpmd: 26314710。

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